分泌作用
附睾液的成分与睾网液有很大的不同,这不仅是由于附睾的吸收作用,更主要的是因为附睾能分泌多种物质,包括离子、小分子有机物、糖蛋白等等。它们对维持附睾腔内渗透压及精子成熟有关,其作用受雄激素等因素的调节。
(一)电解质、水和液体的分泌
附睾为精子的成熟和储存提供了良好液态微环境。而这种液态微环境的产生受阴离子(如cl一、c鸥一等)的主动分泌的驱动,这些阴离子从血管分泌到附睾管腔中,驱动水分泌的渗透梯度。离子的分泌主要靠离子泵、离子隧道及转运功能,特别是传导a一的小通道,受囊性纤维化跨膜传导调节因子(c盯R)调控,该因子在附睾上皮细胞表达.并在附睾腔面的细胞膜上起作用,在囊性纤维化病变时CFTR基因突变,出现cAMP对该通道的异常调节,导致97%的男性囊性纤维化病人不育。最近发现在非囊性纤维化病人有囊性纤维化相关基因突变时精子运动能力和生育能力低下。提示附睾中电解质和水的转运异常在男性生育中具有十分重要的意义。附睾中阴离子和水的分泌也受神经递质、激素和自主分泌因子调节。多种由附睾合成的生理活性多肽、可作用于附睾上皮细胞的顶部和基底面的膜受体而发挥调节作用。附睾中的精子也能通过释放某些因子与附睾上皮细胞膜受体结合,调控电解质和水的分泌。患YOung综合征时附睾水和电解质分泌障碍,导致附睾腔内脱水,浓缩的粘液可造成阻塞性无精子症。此外,附睾炎症或病变也可改变精液的酸度。
附睾上皮能分泌K+、Ca2+、Cu2+、P3-至管腔中,甲状旁腺激素在调节这些离子的分泌中可能起一定的作用。用雄激素拮抗剂醋酸氯羟甲烯孕酮处理后,K+、Cl-及水的分泌和转运均被抑制,表明电解质和水分泌受雄激素水平影响,水电解质的转运在附睾尾部作用最强,附睾体中部和远部最低。在电解质和水转运被抑制时,附睾尾部不活动精子的百分率增高。
附睾体上皮细胞顶部有乳酸脱氢酶辅酶黄递酶,能将血液中的乳酸盐传递到附睾腔内,乳酸盐氧化可为精子提供能量。大鼠附睾液中长链脂肪酸浓度为lmmol/L,相当于血液的5倍,这是精子可利用的能源,同时也是合成甘油磷酸胆碱(GPC)与PGF2α的原料。附睾各段上皮均能合成GPc,从附睾头至尾,其含量逐渐增加,附睾尾部高浓度的GPC可以起到抑制精子代谢的作用。因为精子在雄性生殖道中不能对GPc进行代谢,这与磷酸二酯酶缺乏有关,而雌性生殖道中含有此酶,可分解GPC产生甘油,提供精子氧化代谢需要。GPC可能为精子储备的能量。临床上检测精液GPC的含量可反映附睾的功能。此外,附睾还能分泌肌醇等,附睾中肌醇的浓度很高,至附睾尾部可达30mmool/L。
(二)附睾上皮分泌多种蛋白质
附睾头部合成蛋白质最为活跃,并可被醋酸氯羟甲烯孕酮抑制。这些蛋白质与精子成熟和功能活动有密切关系。
(1)前向运动蛋白:为分子量3.7kD的酸性糖蛋白,免疫组化实验证明它由附睾上皮细胞分泌。当前向运动蛋白与附睾中精子表面的前向运动蛋白受体结合后,可促使精子产生前向运动。附睾中未成熟精子,在同时加上前向运动蛋白与茶碱时(用来抑制磷酸二酯酶)才能使精子有完善的前向运动能力。前向蛋白中含有甘露糖与葡萄糖,其糖基具有重要作用。当用β一半乳糖苷酶、α一甘露糖苷酶、半乳糖氧化酶、唾液酸酶处理后前向运动蛋白活性明显减弱。精子在附睾运行过程中,膜表面刀豆蛋白A(ConA)受体增加,可能与前向运动蛋白结合到精子膜上有关。
(2)人附睾蛋白:用分子生物学的方法证实了多种附睾分泌蛋白,其中有HE1-HE6,HE1可能与脂质转运有关。精子的胆固醇/磷脂比率和脂质的流动性对精子获能和顶体反应起决定性的作用。一些不育症患者的精子的胆固醇量减少,从公羊附睾液中分离纯化出一种蛋白,它可能是胆固醇转运蛋白,其cDNA编码N一末端氨基酸序列以及其他已知的特性都与HE极为相似。用抗血清证明HE1cDNA编码人附睾中的一种分泌性糖蛋白,它聚集于附睾尾部液中,在射出的精子上也有,但只是疏松地连接在精子上。HEl可能是去(获)能因子,通常认为当精子在附睾中运输和储存时它可维持精子的胆固醇量。在精子获能时HE1丢失,同时伴随胆固醇的丢失。
HE2是人附睾近端分泌的一种蛋白,是人类特异的。目前用cDNA探针和免疫学方法尚未在动物中发现有HE2的同源物质。抗重组HE2的抗体特异性地与人射出精子的顶体和赤道部反应。HE2,抗原可能与精卵融合有关。
HE4可能是附睾远端的分泌性糖肽,它富含半胱氨酸有两个乳清酸蛋白的区域。在精浆中也有HE4,它被覆在精子表面可保护精子和附睾上皮不受白细胞或顶体的蛋白酶的损伤。在体外获能的条件下,HE4从精子-表面上分离下来。HE4和H2相似,它们与精子膜表面直接连接。
HE5是一种分泌性糖蛋白,与淋巴细胞抗原CD52是同一物质,HE5与HE2、HE4不同,HE5以细胞一细胞转递方式通过GPI固定结构插入精子膜中与精子连接。HE5/CD52是附睾、输精管、精囊等生殖道上皮细胞产生的。除淋巴细胞外,附睾远端上皮是最主要的CD52表达位置。CD52mRNA水平受到温度的明显影响,在犬附睾上皮细胞培养中,CD52mRNA出现于细胞培养5天后。以体温(37~C)培养与阴囊温度(33.C)下培养相比,较高的温度可特异性的下调CD52mRNA的水平。从实验性单侧隐睾的动物中发现隐睾侧的附睾管内CD52mRNA水平显著低于正常对照侧,CD52的表达也受雄激素的调节阉割或切断睾丸输出小管可使cD52mRNA水平下调,祛除雄激素和提高温度对调控CD52nRNA水平有协同作用。有生育能力者和不育症病人相比CD52免疫染色阳性的精子百分率无明显差异。同样正常精子与畸形精子的CD52染色百分率也无显著变化。但弱精和少精者精子CD52染色阳性百分率比正常分别低20%和27%,而染色强度在少精者比弱精者高1倍。附睾CD52抗原可能与精子功能的成熟有关。
HE6是一种受体,其配体的性质目前尚属未知。HE6的N一末端类似于淋巴细胞表面分子TM7,它可能与粘黏/解粘黏的过程有关。
(3)GPXs等抗氧化酶:从小鼠cDNA文库中,克隆出GPX5(谷胱甘肽过氧化物酶5),它是GPX家族新成员。作为一种分泌蛋白,能结合到精子上,以免细胞受脂质过氧化损伤,该酶的缺乏可导致受精能力降低。相应的mRNA主要表达在附睾头部。mRNA浓度增加与附睾中睾酮和双氢睾酮(DHT)含量增加相平行。去睾丸后其mRNA水平迅速下降,30天后已测不到,注射睾酮,可使去睾丸小鼠(GPXsmRNA水平提高,治疗10天后mRNA水平达到未受损动物水平,最终,当附睾中DHT量恢复正常时,该mRNA水平也完全恢复稳定状态,表明其转录受雄激素的调控。
除了GPX外,附睾还可以产生多种抗氧化的酶类,附睾中有Cu2+—Zn2+超氧化物歧化酶(SOD)、分泌性超氧化物岐化酶(E-SOD)、磷脂过氧化物酶(PHGPx)等酶的mRNA的表达。这些酶可以清除附睾中氧化反应中产生的有害产物、超氧化物、自由基等,以保护精子不受氧化损伤。与GPXmRNA的表达部位不同,E-SOD mRNA主要表达在附睾的体部,这些酶分布的区域特异性可与附睾功能的区域性有关,同时也表明附睾各段对抗氧化酶的需求是多样化的。
一些研究提示运动不良的精子脂质氧化反应率明显高于正常精子,而SOD等能抑制该反应,一些男性不育症患者精浆SOD降低,产生过量的氧自由基和脂质过氧化反应。
(4)特异性附睾糖蛋白(AEG):是一种主要由附睾头部上皮细胞分泌的酸性糖蛋白。以抗血清测定培养的大鼠附睾上皮细胞,AEG反应几乎见于附睾头、体、尾全部上皮。它可结合在精子的顶体部与尾部,能增加精子固着于透明带的能力。
(5)糖基转移酶与糖苷酶:糖基转移酶能将糖基转移到精子表面的糖蛋白的糖链上,而糖苷酶则可将精子表面的末端糖基去除,从而改变原来的末端糖基。研究表明a一糖苷酶在附睾上皮细胞顶部胞质内显示较强的活性,在睾丸输出小管中活性较弱,而在睾丸中则无该酶活性,该活性有明显的种属差异和在附睾各段的区域性差异。在大鼠a一糖苷酶于附睾头部活性最强。10~20日龄大鼠无该酶表达,30日龄后可测出该酶,在去势后附睾各段该酶活性均明显降低。精浆中a一糖苷酶的含量丰富,是测定附睾功能的重要指标之一。一些精液中有脱落纤毛束的不育症患者a一糖苷酶活性降低附睾功能受损。在精道阻塞时精浆a一糖苷酶活性较附睾炎症时更低。研究还证明大鼠附睾头部具有半乳糖苷酶,N一乙酰葡萄糖苷酶,体部出现α.葡萄糖苷酶等。
(三)分泌涎酸
附睾上皮能分泌涎酸,涎酸是一种重要的多糖,对动物(大鼠)附睾中涎酸的组织化学分析发现涎酸有多种类型,它们在附睾的各段以及各种细胞上分布不一。在附睾起始段和头部的主细胞上的涎酸连接着α一2,6一半乳糖/N一乙酰半乳糖胺,然而在附睾体部和尾部则是含α一2,3一半乳糖的涎酸,基细胞和晕细胞主要含α一2,3一半乳糖的涎酸,8或9位乙酰化的涎酸主要分布于附睾起始段和尾部近侧端的主细胞上。这种涎酸类型及分布的差异与附睾各部生理功能差异有关。涎酸在附睾液中可呈游离状态或与蛋白结合形成涎酸糖蛋白。从附睾头部到尾部附睾液内涎酩的量逐渐增高,涎酸结合到精子表面发挥了重要的生理作用。首先涎酸的结构中含有羧基,带有负电荷。精子在附睾中运行并成熟的过程中表面负电荷不断增加,这主要是因为结合到精子表面的涎酸增多的缘故。其次涎酸可起免疫性保护作用,掩盖精子表面的特异性抗原,这可使精子在附睾中运行和成熟时不被自身免疫细胞识别而产生自身免疫反应。例如猪精子表面的S2P3抗原,该抗原在精子发生晚期出现,位于顶体后区。该区在受精过程中有重要作用,由于涎酸掩盖了S2P3使精子顺利成熟免受免疫损伤。涎酸与精子结合对维持精子的细胞膜稳定性和完整性也有重要作用,特别是稳定了精子顶体区的细胞膜,以保证精子在附睾内不发生顶体反应。此外涎酸与附睾液离子平衡的维持有密切关系。
(四)肉毒碱
虽然附睾上皮并不具有合成肉毒碱所需的酶,也不能产生肉毒碱。但附睾上皮能将血液中的肉毒碱转运入附睾液。这种转运作用主要在附睾头部远端和体部。附睾液内肉毒碱含量从附睾头向尾部逐渐提高。在睾丸中精子不含肉毒碱。进入附睾的精子不断地从附睾液内摄取肉毒碱,故精子细胞内的肉毒碱含量也随着精子向附睾尾部运行而不断增加,肉毒碱位于精子线粒体内膜中,具有乙酰转移作用。参加能量代谢产生ATP,为精子运动等提供能量。此外,检测精浆中的肉毒碱、甘油磷酸胆碱等附睾分泌的特异性物质,可鉴别阻塞性或分泌性无精症。同时也反映了附睾的功能状态。