睾丸组织结构定量特征中，人们通常对生精细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞的数量最感兴趣。这些细胞是单核的细胞，加之切片上细胞核的边界通常最清晰而且形状最规则，人们习惯上通过估计细胞核数来估计细胞数。成年人或猴的每个Sertoli细胞核一般都有而且只有一个较清晰的核仁，利用体视框(下述)通过直接计数核仁数来估计细胞数似更好。数目，听起来是最原始最简单的数字特征，但从方法技术上讲显微粒子数的估计却是问题最多技术要求又最高的。

　  一、流式细胞仪

　　制作组织匀浆或细胞悬液，用荧光染料染色，就可利用流式细胞仪计数不同DNA含量或倍体的细胞核数。睾丸组织中，精原细胞、Sertoli细胞、Leydig细胞和其他非生精细胞属双倍体，初级精母细胞以及处于G，分裂期的精原细胞和非生精细胞属于四倍体，精子细胞属于单倍体。因此睾丸组织的流式细胞仪检查可测定各级生精细胞DNA倍体的变化，从而间接判断不同生精细胞数目相对比例变化的趋势。例如，单倍体细胞数所占百分比下降可能说明精子细胞数量减少，即精子发生过程中精子形成障碍或精亏发生抑制，但以下三种情况也可能引起该百分比下降：①单倍体细胞数不变，其他细胞壹相对增加；②单倍体细胞数增加，其他细胞世增加但增加得相对更多；③单倍体细胞数秒减少，其他细胞也减少只是减少得相对较少。类似地，该百分比不变可能说明精子发生未受影响，但以下两种情况也可能出现这种结果：①单倍体细胞和其他细胞都成比例地蝗加；②单倍体细胞和其他细胞都成比例地减少。因此．姑且不论细胞的准确辨认以及缍织匀浆过程中的细胞粉碎等问题，流式细脆仪估计细胞数至少有这样一个严重缺陷：一般只能反映细胞的相对数目比，而不能确定睾丸内所测细胞是否真的有所增加、减少或不变。

　  二、轮廓计数方法

　　人们所看到的细胞核通常都是在切片上观察到的细胞核断面——轮廓。单位面积组织切片内细胞核轮廓的数量与单位体积组织内细胞核本身的数量之间势必有一定的联系，因此人们以往常用轮廓数来表示细胞核数。以往用以反映生精细胞数量变化的最常用指标是：每个精曲小管横断面内生精细胞核的轮廓数，或者每个精曲小管横断面内生精细胞核的轮廓数与Sertoli细胞核的轮廓数之比。假定精曲小管的长度不变，且生精细胞的尺寸和形状也不变，前者可反映睾丸内生精细胞的总数；鉴于成年动物的sertoli细胞已不再增殖，假设Sertoli细胞数的个体差异可忽略不计(实际未必如此，见下述)，且假定Sertoli细胞的尺寸与形状不变(实际未必如此，见下述)，后者也可用以反映睾丸内生精细胞的总数。这种指标的估计通常这样进行：先随机选精曲小管横断面(见图58一  1)，然后计数这些精曲小管轮廓内生精细胞  核以及Sertoli细胞核轮廓的数目。如果这  样要计数的细胞太多，可只计数随机抽选的半个或1／4象限的精曲小管轮廓。

　　轮廓数毕竟不等同于细胞数。一个精曲小管横断面内有100个轮廓，并不就是说“该精曲小管”有100个细胞核。细胞核的数目既与细胞核轮廓数相关(成正比)，又与细胞核的直径相关。直径愈大，在切片上形成轮廓的机会也愈大。对于等大的球形细胞核来讲，二者相结合就可估计细胞核数密度(单位体积器官组织内细胞核的数目，或者说细胞核总数除以器官组织体积)Nu：

　  Nv=NA／D

　　式中NA指的是单位面积的切片组织内细胞轮廓的数目(等于计数的细胞核轮廓总数除以用于轮廓计数的切片组织内的测试框的总面积)，D指的是细胞核的直径。Nv乘以器官组织的总体积即得器官组织内细胞核的总数。实践中该方法主要适合于大小分布较均匀(变异系数小)的球型粒子。

　　上述根据轮廓计数来估计细胞核数的方法无论怎样都有偏差，偏差来源于对细胞核形状和大小的假设。实际器官组织内的粒子不可能等大，而直径愈大的粒子在单一切片(二维截面)上形成轮廓的机会愈大，因此利用单一切片(二维截面)无论如何都不能均匀抽选或计数粒子，因而不能无偏估计粒子的数目等。

　　例如，正常情况下一个初级精母细胞经过两次成熟分裂后应该形成四个精子细胞，但一二十年前有研究根据轮廓计数得出结论：成人的一个初级精母细胞实际上只平均形成了2．58个或2．14个精子细胞，36％～47％的精子细胞丢失或退化。该结论现已被文献广泛引用。但利用新一代元偏体视学技术——光学体视框(见下述)的两项定量研究表明：①正常成年猴精子发生的效率很高，从B型精原细胞开始各种生精细胞的转换率都接近理论最大值；②在正常成人，一个粗线期初级精母细胞实际上也转换成了3．7个球形精子细胞，接近理论最大值4．0，因而说明成熟分裂的效率高，精子细胞(相对于初级精母细胞而言)的丢失，如果存在的话，不超过10％，或者，精子细胞和精母细胞的丢失呈正比，所以二者的数目比未受影响。　  ‘

　　又有研究对比了上述有偏轮廓计数方法和另一类无偏体视学新方法——体视框(见下述)，结果表明：①仅就正常对照组而言，两种方法估计的大鼠睾丸内L~eydig细胞核的数目无显著性差异；②正常对照组与精子发生抑制组(利用睾酮和雌二醇皮埋造成促性腺激素分泌抑制)相比，利用轮廓计数方法(有偏)所得的结论是二者之间无显著性差异，即精子发生抑制组不伴有Leydig细胞数的减少，而利用体视框(无偏)研究所得的结论却是：精子发生抑制组的Leydig细胞数显著减少了百分之四五十(与正常对照相比)。造成这种矛盾的原因是：正常组的Leydig细胞核较近似球体，而促性腺激素抑制后的Leydig细胞核不那么近似球体了，而且细胞核体积显著减少。

　  三、体视框

　　体视学估计都是借助测格的抽样估计，犹如将一定形状的“探针”——_钡格(测点、测线和测试框)随机插入待测空间(器官组织)内去抽选并测量那些被“探针”探测到的待测结构。体积愈大的粒子被0维测点击着的机会愈大，表面积愈大的粒子被一维测线穿过的机会愈大，直径或高度愈大的粒子被二维测试框截着的机会愈大。因此，不等大的粒子不能利用测点、测线或测试框均匀(即每个粒子都有相同的机会)抽选或计数，但单一切平面上又只能叠加测点、测线或测试框。必须利用三维测试框才能无偏抽选或计数粒子，体视框(disector)就是一种三维测试框，其中估计细胞核数目最有效最理想的技术是光学体视框。例如，光学体视框技术可这样实现：

　　切取25／,m厚的甲基丙烯酸树脂包埋的睾丸组织切片，PAS处理后苏木精染色。用高数值孔径(1．30～1．40)的油镜观察切片，这既是为了更清晰地观察结构，又是为了能“断层扫描”观察厚切片内的不同聚焦平面——光学切片，聚焦平面的景深(光学切片的厚度)一般不大于0．25／,m。通过摄像机和接合器将切片图像显示在电脑显示器上。利用测试系统软件在组织图像上生成并叠映一个或多个面积为a(一般1～300vm2)的长方形测试框。在厚切片内从上到下连续聚焦观察10gm，利用精密的装置来精确测量并显示显微镜载物台上下移动的距离，利用油镜观察切片时该距离就相当于聚焦平面在切片组织内上下移动的距离。在这10vm厚的切片组织内观察并计数测试框“内”新出现的各种细胞核(包括长形精子细胞核)(图58．2)。一个二维测试框在空间内上下移动，实质上构成了的一个三维测试框。细胞核是否在测试框“内”的判断方法如图58—1所示。假如从整个睾丸共随机观察了n个测试框(视野)，那么用于计数细胞核的切片组织的总体积为10·n·a(ptm3)；假如共计数了一个细胞核，那么睾丸组织内所测细胞核的数密度为：∑Q一／(10·n·a)，该密度即每立方微米的睾丸组织内细胞核的数目。假如睾丸的体积为V(vm3)，那么这个睾丸内所测细胞核的总数为：V·∑Q一／(10·n·a)。sPrtnli细晌核核仁的计数原则同上．

　　如果不具备实现光学体视框技术的条件，可采用物理体视框，即利用多张(至少两张)连续切片，相应视野上显微摄影可得一系列的照片，这样就可根据上述原理计数细胞核。物理体视框的最大困难是粒子的配比。即某一切片视野上所见的细胞核轮廓，与相邻切片相应视野上所见的细胞核轮廓对比。哪些是由同一细胞核形成的，哪些不是同一细胞核形成的，因此物理体视框的效率极低。

　　利用光学体视框估计的正常成年猴和人的生精细胞及Sertoli细胞数见表58—1。

　　正常大鼠精原细胞总数出生后逐渐增加，到30天龄后数量稳定在18．4～23．6(百万／每侧睾丸)左右，以后至70天龄时都无显著改变。初级精母细胞在15天龄的大鼠开始出现，至30天龄时数量达54．6百万．70天龄时逐渐升至73．6百万。球形精子细胞(1～7期)在25天龄时开始出现，40天龄时迅速升至85．7百万，70天龄时继续升至151．9百万(这些数据是根据轮廓计数所估计的数密度乘以睾丸体积所得)。

　　大鼠出生时15天、30天、40天和70天龄时每侧睾丸的体积分别约为5、57、278、645、1281mm3。大鼠出生时约有1．4百万个Seroli胞(每侧睾丸)，15天龄时增至30～38百万，以后(至70天龄)其数量无显著性变化(这些数据由睾丸内Sertoli细胞核总体积除以细胞核平均体积所得)。

　　SertOli细胞在精子发生开始启动后一般就不再分裂，数量相对恒定，而且一般认为Senoli细胞支持一定数量的生精细胞。例如，大鼠出生后用FSH治疗可增加Sertoli细胞的数量，因而也增加了生精细胞的数量和睾丸体积。正因为如此，以往人们都常用生精细胞数与Sertoli细胞数的比值来表达生精细胞的数量。这种比值有两个问题，一是变异增大；二是Sertoli细胞数与生精细胞数未必高度相关，Sertoli细胞支持一群生精细胞的能力的个体差异可能很大，因而这种参数就未必能很好的反映生精细胞的真实数量。例如，有几项研究的结果显示，正常成人(5个)的Sertoli细胞总数与生精细胞总数显著相关(相关系数为0．91)，但正常成年猴(10个)的Sert01i细胞总数与生精细胞总数不显著相关(相关系数为一0．17)；相比之下，睾丸体积与生精细胞数量之间均显著相关。